霉菌的形态观察实验

（1）学习并掌握观察霉菌形态的基本方法

（2）了解常见霉菌（根霉、毛霉、曲霉、青霉、红曲霉、白地霉）的基本形态特征

霉菌可产生复什分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多（约3～10μm），常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。观察霉菌的形态有多种方法，常用的有直接制片观察法、载玻片培养观察法和玻璃培养观察法三种方法。

（1）菌种：根霉（Rhizopussp.）、毛霉（Mucorsp.）、曲霉（Aspergillussp.）、青霉（Penicilliumsp.）、红曲霉（Monascussp.）的平板培养物，白地霉（Geotrichumcandidum）摇瓶培养液。

（2）培养基：土豆琼脂培养基（PDA）或查氏培养基。

（3）溶液或试剂：乳酸石炭酸棉蓝染色液。

（4）其他：无菌吸管，平皿，载玻片，U形玻璃棒，盖玻片，解剖针，显微镜等。

实验步骤：

1.一般观察法

（1）点种培养：用接种针沾取斜面少许孢子在无菌的查氏培养基中央穿刺接种（倒置培养皿穿刺接种），30℃下培养7-10天，形成巨大菌落培养物。

(2)直接制片

于洁净载玻片上，滴一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从霉菌菌落的边缘处取小量带有孢子的菌丝置染色液中，再细心地将菌丝挑散开，然后小心地盖上盖玻片，注意不要产生气泡。置显微镜下先用低倍镜观察，必要时再换高倍镜。

观察毛霉时，注意观察其菌丝无横隔、孢子囊柄、囊轴、孢子囊孢子及后垣孢子；观察曲霉时，注意观察其菌丝有横隔、足细胞、分生孢子梗、顶囊、小梗（形状、层数及着生情况）、分生孢子；观察青霉时，注意观察其菌丝有横隔、分生孢子梗、帚状枝（小梗的轮数及对称性）、分生孢子；观察红曲霉时，注意观察其菌丝有横隔、分生孢子着生情况、闭囊壳、子囊孢子。

2.载玻片观察法

（1）将略小于培养皿底内径的滤纸放入皿内，再放上U形玻璃棒，其上放一洁净的载玻片，然后将二个盖玻片分别斜立在载玻片的两端，盖上皿盖，把数套（根据需要而定）如此装置的培养皿叠起，包扎好，用1.05kg/cm2，.3℃灭菌20分钟或干热灭菌，备用。

（2）将6-7ml灭菌的马铃薯葡萄糖培养基倒入直径为9cm的灭菌平皿中，待凝固后，用无菌解剖刀切成0.5-1cm的琼脂块，用刀尖铲起琼脂块放在已灭菌的培养皿内的载玻片上，每片上放置2块。

（3）用灭菌的尖细接种针或装有柄的缝衣针，取（肉眼方能看见的）一点霉菌孢子，轻轻点在琼脂块的边缘上，用无菌镊子夹着立在载玻片旁的盖玻片盖在琼脂块上，再盖上皿盖。

（4）在培养皿的滤纸上，加无菌的20%甘油数毫升，至滤纸湿润即可停加。将培养皿置28℃培养一定时间后，取出载玻片置显微镜下观察。

3.玻璃纸透析培养观察法

（1）向霉菌斜面试管中加入5ml无菌水，洗下孢子，制成孢子悬液。

（2）用无菌镊子将已灭菌的、直径与培养皿相同的圆形玻璃纸覆盖于查氏培养基平板上。

（3）用1ml无菌吸管吸取0.2ml孢子悬液于上述玻璃纸平板上，并用无菌玻璃刮棒涂抹均匀。

（4）置28℃温室培养48小时后，取出培养皿，打开皿盖，用镊子将玻璃纸与培养基分开，再用剪刀剪取一小片玻璃纸置载玻片上，用显微镜观察。

实验绘图：

6注意事项：

（1）在直接制片观察法中，用镊子取菌和用解剖针分散菌丝时要细心，尽量减少菌丝菌丝断裂及形态被破坏，盖盖玻片时避免气泡产生。

（2）在载玻片培养观中，注意无菌操作，接种量要少并尽可能将分散孢子接种在琼脂块边缘，避免培养后菌丝过于密集影响观察。

（3）观察时应适当调整，这样可以看清菌丝在各个方位的立体图像。

（4）培养时要注意无菌操作，以防杂菌影响所需要观察的霉菌的生长，影响观察。

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